Los efectos del metotrexato son: antiinflamatorio e inmunosupresor. Interfiere principalmente con la síntesis de folato intracelular, que es la materia prima para la síntesis de ADN intracelular y RNA, por lo que el metotrexato puede inhibir la proliferación anormal de células. Especialmente para aquellas células que crecen rápidamente, el efecto del metotrexato es el más obvio, y para aquellas células que crecen básicamente estables, el efecto es pequeño. Debido a que las células tumorales en pacientes con tumores también están proliferando de manera anormal, la aplicación de metotrexato puede matar estas células y lograr el efecto de tratar tumores.

El metotrexato se usa en leucemia linfoblástica aguda, linfoma, lunar maligno, carcinoma coriónico, carcinoma epitelial escamoso, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama y sarcoma osteogénico.